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核酸定量檢測試劑實驗前準(zhǔn)備工作

更新時間:2025-05-26      點(diǎn)擊次數(shù):376
  核酸定量檢測試劑(如熒光染料法、探針法或數(shù)字PCR試劑)是分子生物學(xué)實驗中的核心工具,其使用規(guī)范直接影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下是詳細(xì)的操作規(guī)范和注意事項:
  一、核酸定量檢測試劑實驗前準(zhǔn)備:
  1.試劑與材料檢查
  試劑完整性:確認(rèn)試劑盒組件完整(如反應(yīng)液、酶、陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)品等),無泄漏或污染。
  儲存條件:確保試劑未過期,儲存溫度符合要求(如-20℃避光保存,部分需冷藏或冷凍)。
  耗材滅菌:使用無菌離心管、吸頭、PCR管等,避免核酸污染。
  2.儀器校準(zhǔn)與維護(hù)
  PCR儀:校準(zhǔn)溫度準(zhǔn)確性。
  熒光檢測儀:設(shè)置正確的激發(fā)/發(fā)射波長,調(diào)整增益值。
  移液器:校準(zhǔn)移液體積,建議使用帶濾芯吸頭避免交叉污染。
  3.實驗設(shè)計
  對照組設(shè)置:
  陽性對照:已知濃度的靶核酸(驗證試劑有效性)。
  陰性對照:無模板空白(檢測污染或假陽性)。
  標(biāo)準(zhǔn)曲線:至少5個梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品,用于定量計算。
  樣本處理:提取核酸后測濃度,確保純度達(dá)標(biāo)。
  二、核酸定量檢測試劑操作規(guī)范:
  1.反應(yīng)體系配制
  冰上操作:在低溫環(huán)境中配制預(yù)混液,減少非特異性擴(kuò)增。
  精準(zhǔn)加樣:按試劑盒說明書添加各組分(如模板DNA、引物、探針、熒光染料),建議先配制標(biāo)準(zhǔn)品再處理樣本。
  避免氣泡:混勻后短暫離心,確保反應(yīng)液集中于管底。
  2.PCR擴(kuò)增
  循環(huán)參數(shù):嚴(yán)格遵循試劑盒推薦的循環(huán)條件。
  熒光采集:在退火或延伸步驟末尾檢測熒光信號(避免信號飽和)。
  防污染措施:
  分區(qū)操作(試劑配制區(qū)、加樣區(qū)、PCR產(chǎn)物分析區(qū))。
  使用紫外燈或核酸清除劑定期消毒實驗臺。
  3.數(shù)據(jù)分析
  基線校正:選擇指數(shù)擴(kuò)增階段的熒光信號作為分析窗口。
  閾值設(shè)定:手動或自動設(shè)定閾值,確保標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的Ct值在合理范圍內(nèi)。
  標(biāo)準(zhǔn)曲線法:
  以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo),擬合線性方程。
  根據(jù)樣本Ct值代入方程計算靶核酸濃度。
  結(jié)果驗證:
  陽性對照應(yīng)呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,陰性對照無信號。
  重復(fù)實驗至少2次,確保數(shù)據(jù)可重復(fù)性。
 

 

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